组织解离流程
备物
- 液体：PBS；1640；
- 酶：混合酶；胰酶；1X裂红液（无酶水稀释）；
- 工具：巴氏管；培养皿；冰盒；消毒过的剪刀和镊子；滤网；离心管；EP管；计时器；水浴箱预热37℃
第一步 剪碎组织
- 将组织及保存液，PBS倒入6cm培养皿中，剔除筋膜和脂肪组织后（乳腺癌可适当保留脂肪组织），用注射器针头在冰上切碎细胞，最终将细胞碎片直径1-3mm（直径小于巴氏管的管口）；
- 用宽口枪头吹打混匀后，将培养皿中的液体及组织转移至5ml EP管中，用纯PBS清洗；每次清洗时将组织吹开，然后置于冰上自然沉降，重复2-3次直至上清液澄清。
第二步 混合酶消化
- 去上清后，加入混合酶后放入37℃ 125rpm摇床，30min后观察，消化完成后筛网过滤，沉淀离心（400g，7min），剩余组织行胰酶消化
【乳腺癌专用混合酶配方】
胶原酶I 0.8mg/ml
胶原酶II 0.8mg/ml
中性蛋白酶 1mg/ml
透明质酸酶 30u/ml
1-2% BSA
注：2-5ml EP管，加入酶的体积约等于组织量体积的10倍以上，若2-3条组织，可加入1-1.5ml混合酶，放入2mlEP管内上摇床，若EP管过大，振动幅度太大会造成细胞死亡，若太小，则又混匀不充分。观察时间：间隔10min，上清变浑浊后可5-8min观察。
是否需加入胰酶视情况定，加入量同常规比例。
【皮肤专用混合酶配方】
胶原酶IV 2 mg/ml
中性蛋白酶 0.8 mg/ml
DNA酶 1 mg/ml
透明质酸酶 50 u/ml
1-2%BSA
剪碎皮肤组织后EDTA（20mM） 37℃水浴震荡30min
第三步 胰酶消化
- 若还有剩余组织，可加入胰酶行第二次消化，同样37℃ 125rpm摇床，30min后观察，消化完成后筛网过滤，再次沉淀离心（400g，7min），剩余组织可从第二步开始重新消化
第四步 细胞悬液获取
所有步骤获得的沉淀用1640或PBS重悬后计数
单细胞上机标准：细胞活性>85%；有核率>70%；结团率<20%。结团率如认为不可靠，可在显微镜下进一步观察。
特殊情况处理
【有核率低→裂红】：
- 细胞悬液离心后
- 沉淀中加入1X裂红液1-2ml（细胞体积的10倍），冰面上裂解5-6min
- 加入1-2倍PBS终止裂红，也可不终止直接离心，体积过大会损失较多细胞。
- 离心300g，7min，4℃，去除上清
- 1640重悬（5%），计数。